重组 DNA 技术的工具、载体与应用解析

# 重组DNA技术
- 工具酶
  - 限制性内切酶
    - 作用
      - 识别特定 DNA 序列
      - 切割方式
        - 粘性末端
        - 平末端
    - 应用
      - 构建重组 DNA 分子
  - DNA 连接酶
    - 作用
      - 催化磷酸二酯键形成
    - 应用
      - 连接外源 DNA 与载体片段
- 载体
  - 质粒载体
    - 特点
      - 细菌来源
      - 独立于染色体
    - 元件
      - 复制原点
      - 多克隆位点
      - 筛选标记
    - 应用
      - 外源基因插入
      - 筛选
  - 噬菌体载体
    - 类型
      - 如 λ 噬菌体
    - 特点
      - 容纳较大外源 DNA 片段
    - 应用
      - 通过感染导入宿主
  - 细菌人工染色体
    - 特点
      - 大片段 DNA 承载能力
    - 应用
      - 基因组文库构建
  - 真核载体
    - 类型
      - 如酵母载体
    - 特点
      - 适配真核细胞复制与表达
    - 元件
      - 真核调控元件
  - 表达载体
    - 特点
      - 含启动子、终止子等调控序列
    - 应用
      - 外源基因高效表达
- 基本过程
  - 目的 DNA 制备
    - 方法
      - 提取法（生物体来源）
      - PCR 扩增
      - 人工合成（化学法）
  - 载体选择
    - 考虑
      - 宿主类型（细菌/真核）
      - 实验目标（克隆/表达）
  - 体外重组
    - 步骤
      - 酶切（限制酶切割）
      - 连接（DNA 连接酶组装）
  - 基因转移
    - 方法
      - 转化（细菌摄取质粒）
      - 转染（真核细胞导入）
  - 筛选与鉴定
    - 方法
      - 载体标记筛选（抗生素抗性等）
      - 酶切验证
      - 测序确认
- 目的基因表达
  - 原核系统
    - 例
      - 大肠杆菌
    - 优势
      - 操作简单
      - 成本低
    - 局限
      - 密码子偏好
      - 蛋白折叠问题
  - 真核系统
    - 例
      - 酵母
    - 特点
      - 支持翻译后修饰
    - 适用
      - 真核蛋白表达
  - 哺乳动物系统
    - 特点
      - 表达产物接近天然状态
    - 应用
      - 药用蛋白生产
- 技术发展
  - 基因文库
    - 类别
      - 基因组文库（全基因）
      - cDNA 文库（表达基因）
  - 表面展示技术
    - 类型
      - 如噬菌体展示
    - 应用
      - 蛋白质-噬菌体表面结合
      - 筛选分子互作
  - 定点突变技术
    - 作用
      - 精确修改 DNA 序列
    - 应用
      - 研究基因功能
      - 蛋白结构分析
  - 转基因技术
    - 定义
      - 外源基因导入生物体
    - 应用
      - 生物育种
      - 药物生产
  - 基因组编辑技术
    - 例
      - CRISPR-Cas9
    - 特点
      - 精准编辑基因组
    - 应用
      - 基因治疗
      - 动植物改良
    - 发展方向
      - 提高特异